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核酸杂交

发布时间:2007-8-30 访问人数: 2189

核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开,而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行,因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交(Southern blot hybridization )和RNA印迹杂交(Northern blot hybridization)。其基本过程包括下列几个步骤。

  (1)制备样品:首先需要从待检测组织样品提取DNARNADNA应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段,然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱,所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后,直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离,然后转印并交联固定。

  (2)制备探针:探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNARNA或合成的寡核苷酸。在核酸杂交实验中,探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这样,通过检疫与恩印膜上的核酸分子结合上的探针分子,既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置,也就是在电泳凝胶上的位置,也就知道了它的分子大小。

  (3)杂交:首先要进行预杂交,即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子,所以杂交过程中只需变性标记好的探针,再让探针与膜在特定的温度下反应,然后洗去未结合的探针分子即可。

  (4)检测:检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置;而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。

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