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合成细胞培养和缓冲液

发布时间:2015-8-10 访问人数: 1991

合成培养基是根据天然培养基的成分,用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。它有一定的配方,是一种理想的培养基。目前合成培养基多达10多余种,有的培养基仍在不断进行改良。早期组织培养是利用天然培养基,目前合成培养基已经成为一种标准化的商品,从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基,并且还在不断发展。合成培养基的出现极大的促进了组织培养技术的普及发展。
一、基本组分
基本培养基包括四大类物质:无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。
无机盐:CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。
氨基酸:缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L)。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料,不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外,还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用,对细胞的培养特别重要,能促进各种氨基酸进入细胞膜;它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源,还是合成磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是:谷氨酰胺在溶液中很不稳定,故4℃下放置1周可分解50%,使用中最好单独配制,置-20℃冰箱中保存,用前加入培养液中。
维生素:是维持细胞生长的一种生物活性物质,在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶,对细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素(ADEK)常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和B12。维生素C也是不可缺少的,对具有合成胶原能力的细胞更为重要。
碳水化合物:是细胞生命的能量来源,有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。体外培养动物细胞时,几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含
的能源物质。
葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用:乳酸是葡萄糖不完全氧化的产物。研究表明,体外培养条件下95%的葡萄糖转变为乳酸,这降低了营养物质的代谢效率,降低培养基pH值,增加渗透压。在氧气供给不足的情况下,NADH转运系统苹果酸-天冬氨酸穿梭系统活性低而不能将糖酵解产生的NADH氧化磷酸化为NAD+,细胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脱氢酶将糖酵解产生的丙酮酸与NADH反应生产乳酸和NAD+,从而保证了糖酵解的顺利进行。另一个可能的解释是连接糖酵解与TCA循环的特异性酶如丙酮酸脱氢酶复合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下,直接导致糖酵解与TCA循环的失衡。因此体外培养条件下,葡萄糖主要经糖酵解降解,产生过量的乳酸。减少乳酸生产最常用的方法是限制培养基中葡萄糖的含量,但葡萄糖含量过低可造成细胞营养供应不足,细胞生长抑制。该方法需要对葡萄糖的消耗与需求、乳酸的生产速率以及目的蛋白的表达量等参数进行综合考虑方可应用。
在目前常用的培养基中,葡萄糖和谷胺酰胺是体外培养动物细胞的主要能源,其能量代谢通路与体内完全不同,表现为葡萄糖主要经糖酵解途径为细胞提供能量,谷胺酰胺大部分通过不完全氧化途径,另一小部分通过完全氧化为细胞供能。因此,适当的调整细胞内的代谢途径,使之能促进细胞的快速生长和产物合成,同时减少代谢抑制物的生成是行之有效的一种策略。
许多动物细胞如CHOBHK和杂交瘤细胞对营养物质葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而对于细胞生长而言,二者的快速利用并非细胞必需;相反相当一部分转化为代谢废物乳酸和氨,以及一些非必需氨基酸如丙氨酸,脯氨酸。其中,乳酸和氨是两种主要代谢废物,其积累可影响细胞生长以及产品质量。减少这两种代谢产物的积累,是大规模细胞培养技术研究的重要方向。
氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺产生的。限制培养基中谷氨酰胺的含量亦是减少氨生成的常用方法。
除了以上与细胞生长有关的物质以外,培养基中一般还要加入酚红(当溶液酸性时pH小于6.8呈黄色;当溶液碱性时pH大于8.4呈红色),一种pH指示剂。
在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等。有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和辅酶A
二、常用细胞培养基
(1).MEM细胞培养基系列
(2).DMEM细胞培养基系列
(3)RPMI-1640细胞培养基系列
(4).199细胞培养基系列
(5).水解乳蛋白细胞培养基
(6)欧氏平衡盐
(7)F-10,F-12细胞培养基系列
(8)其它类型细胞培养基
三、干粉培养基的配制
配制培养基要注意以下问题:
认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分,常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的,如NaHCO3、谷氨酰胺,有些根据实验需要决定。
配制是要保证充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。
配制所用的水应是三蒸水,离子浓度很低。
所用器皿应严格消毒。
配制好的培养基应马上过滤,无菌保存于4度。
液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基,它是一种灭菌后保证无菌的溶液,必要时可制成无内毒素等的溶液,可节省科研人员的工作量。
配制方法
在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期培养基总体积少5%的双蒸水。
在室温(20℃到30℃)的水中加入干粉培养基,轻轻搅拌,不要加热。
水洗包装袋的内部,转移全部的痕量干粉到容器内。
NaHCO3到培养基中。
用双蒸水稀释到想要的体积,搅拌溶解。注意不要过分搅拌。
通过缓慢搅拌加入1N NaOH 1N HCL调节pH值,由于pH值在过滤时会上升0.10.3,因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0.20.3。培养基在过滤前要保持密封。

无血清技术及其培养基

经历了天然培养基、合成培养基后,无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本,简化分离纯化步骤,避免病毒污染造成的危害。
无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求,但对有些实验却不适合,如观察一种生长因子对某种细胞的作用,这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子;又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)的能力;或者要大规模的培养某种细胞,以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。上海恒利安生物科技有限公司已成功开发了商业化的多种无血清培养基,可满足众多厂商的需求。
一、无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。
用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时,多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长;而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时,由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白,细胞往往以悬浮形式生长。
添加组分包括以下几大类物质:
(1)促贴壁物质:许多细胞必须贴壁才能生长,这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子,一般为细胞外基质,如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子,对许多细胞的繁殖和分化,起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化,这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。
(2)促生长因子及激素:针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质,有些激素是许多细胞必不可少的,如胰岛素。
(3)酶抑制剂:培养贴壁生长的细胞,需要用胰酶消化传代,在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂,以终止酶的消化作用,达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶;抑制剂。
(4)结合蛋白和转运蛋白:常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大,可增加培养基的粘度,保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。
(5)微量元素:硒是最常见的。
二、使用方法:目前,血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物,尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时,常常会先使用有血清的培养液进行培养,待细胞生长旺盛以后,再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程,一般要逐步降低血清浓度,从10%减少到5%3%1%,直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化,是否有部分细胞死亡,存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留,很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前,要留有种子细胞,种子细胞按常规培养于含血清的培养基中,以保证细胞的特性不发生变化。
为了使细胞适应无血清培养,关键的是使所培养细胞:
处于对数生长中期
●>90% 活细胞率
适应时以较高的起始细胞接种
有两种方法使细胞适应无血清培养基(SFM:
1. 直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基(SFM)中。 一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应,接种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105细胞/ml。当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml时,传代培养细胞。当细胞密度在培养47天后达到2×106~4×106细胞/ml时,细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天,当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml,细胞活率在90%时,贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
2. 连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基(SFM)中,与直接适应相比较,连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基:25SFM 混合培养基中,传代培养。
当细胞密度>5×105细胞/ml时,以2×1053×105细胞/ml细胞密度,在有血清培养基:SFM50∶50的混合培养基中传代培养。
2×1063×106细胞/ml细胞密度,25%有血清培养基和75% SFM中传代培养。
当细胞密度达到1×1063×106细胞/ml(接种后46天),在100SFM培养基中传代培养。
每隔35天,当细胞密度达到1×1063×106细胞/ml,细胞活率在90%时,贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物,直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中,最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意,与有血清培养基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白质,因而更易于受外界因素的影响。
细胞培养适应替代血清:许多细胞利用连续适应方法能很好的适应,用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1v∶v)的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式,连续几代减少当前培养基的量:1∶21∶41∶16100%替代培养基。每次适应改变血清比例时,传代细胞23次。
培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清,生长的延迟可能会发生,4允许进行23次的传代,使生长率恢复到以前的水平。
特别需要强调的是:配制无血清培养液必须使用高质量的水,如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子,既便水中的有毒物质含量甚微,也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。
三、使用无血清培养基的优点
增加确定性
性能更加一致
容易进行纯化和下游加工
细胞功能的精确评估
增强生长和/或产量
生理反应性的较好对照
增强细胞内中介物的检测

无蛋白培养基与限定化学成分培养基

一、无蛋白培养基(protein free midium,PFM:即不含有动物蛋白的培养基。无血清培养基仍含有较多的动物蛋白,如胰岛素,转铁蛋白、牛血清白蛋白等。从生物技术发展的趋势来看,不含动物蛋白的培养基又广泛的应用前景,许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体,如果再生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基,纯化过程就比较复杂,最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这发展趋势而出现的,许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。市场上已有适合多种细胞生长的无蛋白培养基。
二、限定化学成分培养基(chemical defined medium,CDM):是指培养基中的素有成分都是明确的,它同样不含有动物蛋白,同样也不是添加了植物水解物,而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的CDM问世,上海恒利安生物科技有限公司生产的水解乳蛋白培养基就属于CDM
其他细胞培养用液

在细胞培养过程中,除了培养基外,还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH调整液等。
一、平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS:主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。最简单的BSSRingerD-Hank"sHank"s的一个主要区别是前者不含有Ca2+Mg2+,因此D-Hank"s常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有较高的NaHCO3(2.2g/L),适合于5%CO2的培养条件,Hank"s平衡液仅含有0.35g/L NaHCO3,不能用于5%CO2的环境,若放入CO2培养相,溶液将迅速变酸,使用时应注意。
配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca2+Mg2+,应当首先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。
二、消化液:取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液,传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来,常用的消化液有胰酶(Trypsin)溶液和EDTA溶液,有时也用胶原酶(collagenase)溶液。
1.胰酶溶液:胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示,常见有11251250,即一份胰酶可消化125250份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度,配制时要用不含Ca2+Mg2+及血清的平衡盐溶液(如前面的D-Hank"s),因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH8-9,配制胰酶溶液应将液体调至pH8左右,充分溶解,过滤除菌。过滤后可以再调只pH7.5,也可不调。
使用细胞清洗液配制胰酶消化液:含0.5%胰酶的细胞清洗液(100ml细胞清洗液加0.5g胰酶),过滤除菌,分装于4度保存。
2.EDTA溶液:EDTA溶液也常用来解离细胞,它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞,还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%,配制时应加碱助溶,配制后可过滤除菌,也可高温消毒灭菌。
3.胶原酶溶液:胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用,胶原酶作用的对象是胶原组织,因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0.1-0.3mg/L200000U/L,作用的最佳pH6.5。胶原酶不受Ca2+Mg2+及血清的抑制,配制时可用PBS
三、pH调整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。
1.NaHCO3溶液:NaHCO3是培养基中必须添加的成分,一般情况下按说明书的要求准确添加,以保证培养基在5%CO2的环境下pH达到设计标准。如果是封闭式培养,即不与5%CO2的环境发生交换达到平衡,所使用的培养基就不能按照说明书所要求加入NaHCO3。此时常用5.6%7.4%NaHCO3溶液调节培养基,使之达到所要求的pH环境。
2.HEPES溶液:是一种弱酸,中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸,对细胞无毒性,主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下,观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境,CO2气体迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES
四、抗生素:常用的是青链霉素,俗称双抗溶液。青霉素主要是对革兰阳性菌有效,链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。通常使用青霉素终浓度0.007-0.008g/100ml,链霉素终浓度0.01g/100ml。一般配制成100倍浓缩液,可用PBS或培养基配制。
五、谷氨酰胺补充液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用,合成培养基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解,4℃下放置7天即可分解约50%,所以都是在使用前添加。配制好的培养液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上时,要重新加入原来量的谷氨酰胺,故需单独配制谷氨酰胺,以便临时加入培养液内。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液,即浓度为200mmol/L29.22g/L),配制时应加温30℃,完全溶解后过滤除菌,分装至小瓶,储存于-20℃。使用时,在每100ml培养液中加入0.5~2ml谷氨酰胺浓缩液,终浓度为1~4mmol/L
六、二肽谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)
在细胞培养液中L-谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分;而L-谷氨酰胺是一种并不稳定的氨基酸,在中性的水溶液中会自发降解;需要频繁地补加L-谷氨酰胺。因而在培养操作过程中经常:
1)频繁打开盖子,增加了破坏无菌状态的可能性;
2)过多的追加L-谷氨酰胺,增加了培养基中氨的毒性水平。
上海恒利安生物科技有限公司已成功开发出用于细胞培养的二肽谷氨酰胺商业化产品。
二肽谷氨酰胺在细胞培养中稳定而不降解,可高压灭菌,释放毒性氨最少!
二肽谷氨酰胺在细胞内被氨肽酶(E.C.3.4.11.2)所水解,产生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸;因此在大部分细胞系统中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同样有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最优替代物,它无需适应;既可用于贴壁细胞培养,也适合于悬浮细胞的培养。

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