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常用缓冲剂的配制

发布时间:2015-8-10 访问人数: 1429
Tris缓冲液
生物学反应仅在氢离子很窄的浓度范围内充分进行。但是,自相矛盾的是许多这样的反应自身在产生或消耗质子。缓冲液是一类在特定的pH范围内耐受可逆质子化作用的物质,因此它在容许的极限内可维持氢离子浓度。完善的缓冲液像圣杯一样,总是可望而不可即的。理想的生物学缓冲液应是:
·pKa在pH 6.0和pH 8.0之间
·对多种化学试剂和酶是惰性的
·高度极性,也就是说在水溶液中能完全溶解而又未必会扩散进生物膜,从而影响胞内pH
·非毒性的
·廉价
·不易受盐和温度效应的影响
·不吸收可见光或紫外光
在分子生物学中所用的缓冲液没有一种完全达到这些标准。已知数量有限的弱酸具有10-7~10-9之间的解离常数。在无机盐中,仅有硼酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐和铵盐处于这种范围之内。但是,它们在某种程度上与生理介质是不相容的。
在1946年,G.Gomori提出,有机多胺可用来将pH控制在6.5~9.7之间的范围内。他研究的三种化合物中的一种是Tris(2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇),其实早在1897年,Piloty和Ruff已,经首次描述过。对于许多生物化学目的而言,Tris成为了非常满意的缓冲液,迄今Tris仍是用于分子克隆中大多数酶反应的标准缓冲液。
表A1-1 各种pH值的Tris缓冲液的配制
所需pH值(25oC) 所需0.1mol/L HCI的体积/mL

7.10
45.7
7.20
44.7
7.30
43.4
7.40
42.0
7.50
40.3
7.60
38.5
7.70
36.6
7.80
34.5
7.90
32.0
8.00
29.2
8.10
26.2
8.20
22.9
8.30
19.9
8.40
17.2
8.50
14.7
8.60
12.4
8.70
10.3
8.80
8.5
8.90
7.0

某一特定pH0.05mol/LTris缓冲液的配制:将50mL 0.1 mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积(mL)0.1mol/L HCl混合,加水将体积调至100ml
Tris缓冲液
Tris初次引起广泛注意的商业的成功之一是在鱼的运输时降低了鱼的死亡率。在20世纪40年代,活鱼是在盛有海水的桶里运往市场的。不幸的是,许多鱼因C02的积聚使pH下降而致死。为了解决这个问题,在水中加入麻醉剂以便使鱼的代谢活动降至最低限度,即使这样也只能部分地得到缓解。这些麻醉剂对那些吃了这种鱼的人到底有什么作用没有记载。1958年,McFarland和Norris在海水中加入Tris稳定其pH,的确降低了鱼的死亡率并使食鱼者愈加爱吃。Tris也成了用于许多生化目的非常满意的缓冲液,也是目前用于分子克隆中大多数酶反应的标准缓冲液。
Tris(羟基甲基氨基甲烷)有很高的缓冲能力,在水中高度溶解,对很多种酶反应是惰性的。但是,Tris也有许多不足之处:
.Tris的pKa值是pH 8.0(20oC),这就意味着在pH值小于7.5和大于9.0时,Tris的缓冲能力是非常低的。
.温度对Tris的解离有显著影响。温度每升高loC,Tris溶液的pH值则降低约0.03 pH单位。例如,0.05mol/L Tris在5oC,25 oC ,37 oC 时,其pH值分别为9.5,8.9和8.6。科学文献中Tris溶液的pH指的是在25 oC 测定的pH。配制Tris的贮存液时,最好是将pH调到所希望的范围,然后使之冷却至25 oC 再进行最终校正。
.Tris与许多类型含有亚麻纤维接头的pH电极起反应,显然Tris能与亚麻纤维起反应。这种影响表现在电动势(emf)漂移,平衡时间加长。因此,具有亚麻纤维接头的电极不能精确测定Tris溶液的pH值。只能使用具有陶瓷或玻璃接头的电极测定Tris溶液的pH值。
.浓度对Tris解离有显著影响。例如,10 mmol/L和100 mmol/L Tris溶液的pH值会相差0.1pH单位,溶液的浓度越大则其pH值越高。
.Tris对许多哺乳动物有毒性。
.Tris作为伯胺,不能用于像戊二醛和甲醛这样的固定剂。Tris也与乙二醛反应。通常用磷酸盐或MOPS缓冲液替代Tris,用于这些试剂。
TRIS是一种在pH 7.5以下缓冲能力很差的缓冲液。在20世纪60年代中期,为了获得在pH 7.5以下具有更好缓冲能力的缓冲液,N.Good和他的同事研制一系列N-取代的氨基磺酸作为生物学上相关pH值的强两性离子。如果没有这些缓冲液,对于分子克隆极为重要的一系列技术要么全然不会存在,要么大大降低工作效率。这些技术包括:哺乳细胞的高效转染(HEPESTricineBES)RNA的凝胶电泳(MOPS)和细菌的高效转化(MES)

缩写词
化学名称
FW
pKa
使用pH值范围
MES
2—(N—吗啉代)乙磺酸
195.2
6.1
5.5—6.7
Bis-Tris
二(2—羟乙基)亚氨基Tris(羟甲基)甲烷
109.2
6.5
5.8—7.2
ADA
N(2—乙酰氨基)—2—亚氨基双乙酸
190.2
6.6
6.0~7.2
ACES
2[(2—氨基—2氧代乙基)氨基]乙磺酸
182.2
6.8
6.1~7.5
PIPES
哌嚓—N,N—hs二(2—乙磺酸)
302.4
6.8
6.1~7.5
MOPSO
3—(N—吗啉代)—2—羟基丙磺酸
225.3
6.9
6.2~7.6
Bis-TrisPropane
1,3—二[tns(羟甲基)甲基氨基]丙烷
282.3
6.8
6.3--9.5
BES
N,N—二(2—羟乙基)—2—氨基乙磺酸
213.2
7.1
6.4—7.8
MOPS
3—(N—吗啉代)丙磺酸
209.3
7.2
6.5~7.9
HEPES
N—(2—羟乙基)哌嚓—N/—(2—乙磺酸)
238.3
7.5
6.8~8.2
TES
N-tris(羟甲基)甲基—2—氨基乙磺酸
229.2
7.4
6.8—8.2
DIPSO
3—[N,N—二(羟乙基)氨基]—2—羟基丙磺酸
243.3
7.6
7.0—8.2
TAPSO
3—[N—tris(羟甲基)甲基氨基]—2—羟基丙磺酸
259.3
7.6
7.0—8.2
TRIZAMA
ths(羟甲基)氨基甲烷
121.1
8.1
7.0-9.1
HEPPSO
N—(2—羟乙基)哌嗪—N/—(2—羟基丙磺酸)
268.3
7.8
7.1~8.5
POPSO
哌嚓—N,N/—二(2—羟基丙磺酸)
362.4
7.8
7.2--8.5
EPPS
N—(2—羟乙基)哌嚓—N/—(3—丙磺酸)
252.3
8.0
7.3~8.7
TEA
三乙醇胺
149.2
7.8
7.4~8.3
Tricine
N—tr诅(羟甲基)甲基甘氨酸
179.2
8.1
7.4--8.8
Bicine
N,N—二(2—羟乙基)甘氨酸
163.2
8.3
7.6—9.0
TAPS
N—tris(羟甲基)甲基—3—氨基丙磺酸
243.3
8.4
7.7--9.1
AMPSO
3—[(1,1—二甲基—2—羟乙基)氨基]—2—羟基丙磺酸
227.3
9.0
8.3—9.7
CHES
2—(N—环己基氨基)乙磺酸
207.3
9.3
8.6—10.0
CAPSO
3—(环己基氨基)—2—羟基—1—丙磺酸
237.3
9.6
8.9—10.3
AMP
2—氨基—2—甲基—1—丙醇
89.1
9.7
9.0~10.5
CAPS
3—(环己基氨基)—1—丙磺酸
221.3
10.4
9.7—11.1

磷酸缓冲液(Gomori缓冲液)
最通用的磷酸盐缓冲液是以其发明者Gomori命名的。该缓冲液是由单价磷酸二氢盐和双价磷酸一氢盐的混合物组成的。通过变化每种盐的量,就可配制出pH 5.8至pH8.0之间缓冲液(见表A1-3A和A1-3B)。磷酸盐有很高的缓冲能力,在水中高度可溶。但是,它们也有不少潜在的缺点:
·磷酸盐缓冲液抑制许多酶促反应和步骤,而这些酶促反应和步骤恰恰是分子克隆的基础,其中包括许多限制酶对DNA的切割,DNA的连接和细菌转化等。
·因为磷酸盐在乙醇中沉淀,不能用于沉淀DNA和RNA。
·磷酸盐螯合像Ca2+和Mg2+这样的阳离子。
表A1-3A 25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制

pH
1 mol/L K2HP04的体积/mL
1 mol/L KH2PO4的体积/mL
5.8
8.5
91.5
6.0
13.2
86.8
6.2
19.2
80.8
6.4
27.8
72.2
6.6
38.1
61.9
6.8
49.7
50.3
7.0
61.5
38.5
7.2
71.7
28.3
7.4
80.2
19.8
7.6
86.6
13.4
7.8
90.8
9.2
8.0
94.0
6.0

注:根据Green(1933)的资料汇编。
用蒸馏水将混合的两种1mol/L的贮存液稀释至1000mL。根据Henderson-Hasselbaleh方程计算其pH值:
pH=pK"+Log,在此,pK"=6.86(25℃)
表A1-3B 25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制

pH
1mol/L Na2HPO4的体积/mL
1mol/L NaH2P04体积/mL
5.8
7.9
92.1
6.0
12.0
88.0
6.2
17.8
82.2
6.4
25.5
74.5
6.6
35.2
64.8
6.8
46.3
53.7
7.0
57.7
42.3
7.2
68.4
31.6
7.4
77.4
22.6
7.6
84.5
15.5
7.8
89.6
10.4
8.0
93.2
6.8

用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000mL。根据Henderson-Hassdbalch方程计算其pH值:
pH=pK"+Log,在此,pK"=6.86(25℃)

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